分枝杆菌的快速检测技术及分子生物学鉴定

一 、 分枝杆菌的快速检测技术

（一） Bactec MGIT960快速培养、药敏检测技术

1 技术特点及原理 以Bactec MGIT960为代表的第二代分枝杆菌快速培养、药敏检测系统，解决了Bactec TB460存在的放射性污染问题，使结核病细菌学检查方法又有进一步发展。Bactec MGIT960的基本原理是其所使用的培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂，该显示剂为氧抑制性，当分枝杆菌生长使氧消耗后，荧光显示剂被激活，而发出荧光。检测系统每60分钟连续测定培养管的荧光强度，以判断管内分枝杆菌生长情况。该培养仪可用于痰、支气管灌洗液、胸水、腹水、脑脊液、尿液、脓液、关节液、病灶组织等。该培养方法阳性率可高达80%左右，而L-J阳性率仅为71%，且大大缩短了培养时间，较L-J培养法需25.7天，该法只需13.3天左右。

2 医院开展情况 此项技术目前在福建省内只有我院检验科开展，并已开展3年多，是一项已经相对成熟的技术。该项目的主要负责人为戴腊梅同志。

3 联系方式 只需将标本交与检验科的同志即可。

（二） 噬菌体裂解试验

1 技术特点及原理 分枝杆菌噬菌体是一种DNA病毒，噬菌体D29对缓慢生长的结核分枝杆菌及快生长耻垢杆菌有亲噬性。其原理是噬菌体感染结核分枝杆菌并在菌体内繁殖，加入杀毒剂，将未进入菌体的噬菌体被杀毒剂杀灭，已进入或活菌体的噬菌体不受影响。噬菌体在菌体内复制，并将菌体裂解。释放出来的噬菌体可随后感染耻垢杆菌并将其裂解。裂解后的菌体在培养平板上表现为噬菌斑，因此可根据噬菌斑的有无判断检测结果。即有噬菌斑表明标本中含有结核分枝杆菌反之为阴性。由于耻垢杆菌生长快速，18-24小时即可出现菌落，因此该法1-2天即可观察结果。由于噬菌斑的数量与待检标本中结核杆菌的含量成正比，因此可根据噬斑的数量推算出待检标本中结核杆菌的数量。该法灵敏度为每毫升10-100条菌，与培养符合率高。该法对结核病人的阳性检出率达81%，特异性为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为37%。

2 医院开展情况 我院检验科已掌握该项技术，如有需要可与检验科联系。该项目的主要负责人为戴腊梅同志。

（三） 聚合酶链反应

1 技术特点及原理   具有特异、敏感、 快 速、 易自动化等 突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。 其基本原理是在高温（ 95 ℃ ）下，待扩增的靶 DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55 ℃ ）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链 DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72 ℃ ）下，以单核苷酸为原料，沿模板以 5 '→ 3 ' 方向延伸，合成 DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形 式迅速扩增，经过 25～30个循环后，理论上可使基因扩增10 9 倍以上，实际上一般可达10 6 ～10 7 倍。 PCR检测TB的优点主要表现如下: 1)能早期诊断TB菌血症: 在TB感染的早期，特别是在TB病灶通过血源性外传播时、及在外周血中存在极少量的TB时，PCR就能给于扩增并确诊。2）时间短;PCR检测TB仅需2-4h 对于某些培养法难以实施的病例， PCR法则行之有效，同时提高了敏感性和特异性，可以检测到1个TB菌。3）有利于鉴别诊断:对于肺结核来说，其中的结核球和成人型原发性结核等，经常易于同肺癌的诊断相混淆，有时涂片检测常是阴性的，在这种情况下，PCR检测就显得特别有效，它不但可以扩增活菌，还可以扩增已死亡的但DNA尚未降解的死菌，从而确定这样的病灶是恶性还是良性。4）抗痨治疗的评价:对于抗痨治疗效果的评价，以前的方法显得软弱无力，而PCR法则可以通过定期检测，采用定量PCR法确切地评价抗痨药物的疗效及残存菌的数量和活性度。

2 医院开展情况 此项技术是我院检验科 目前与解放军三0九医院协作开展的重点项目。

二 、 分枝杆菌分子生物学鉴定

播放型非结核分枝杆菌感染以及以往认为非致病的分枝杆菌引起人类疾病的报道不断增加，而其引起的临床症状与结核病十分相似，且大多对抗结核药物具有一定的耐受性，因此分枝杆菌的快速鉴定十分重要。传统的分类鉴定方法主要是表型分类法，是以形态和生理化特征为依据，时间较长（一般 2-3个月）。分子生物学技术的发展，PCR技术的应用，开辟了分类鉴定的新途径。目前基因鉴定技术具有快速、简便、分辨率高的特点，并可进行多相分类鉴定，能按照种系进化的关系确定精确的位置和定种，使分类鉴定方法更客观合理。下面简要介绍 DNA芯片技术。

DNA芯片技术

通过把巨大数量的寡核苷酸，肽核苷酸或 cDNA固定在一块面积很小的硅片、玻片或尼龙膜上而构成基因芯片。 它主要是基于近年来的一种全新的 DNA测序方法——杂交测序法应运而生的。由于该技术将大量的探针固定于支持物上，所以可以一次性对大量序列进行检测和基因分析，解决了传统的核酸印迹杂交操作复杂，操作序列数量少等缺点。同时基因芯片技术 借助核酸分子杂交配对的特性对ＤＮＡ样品的序列信息进行高效的解读和分析 ,可以在进行分枝杆菌菌种鉴定的同时一次性检测多个耐药基因,具有平行化、集成化、高通量的特点。

这项技术在国内鲜有报道，仅解放军三 0九医院结核病实验室正开展相关研究。目前我院检验科正与 该院合作开展此项课题研究。项 目负责人为科主任张丽水同志，如有需要 鉴定的分枝杆菌菌种，请直接与我院检验科联系。联系方式： 0591-83596886。